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Instituto de Salud Carlos III

CENTRO NACIONAL DE MICROBIOLOGÍA

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Unidad de Genética Bacteriana

Composición del grupo

Jefe de la Unidad:

Adela González de la Campa (Científico Titular del CSIC)

Posdoctorales:

Maria José Ferrándiz Avellano

Montserrat Ortega Doménech

Predoctorales:

Luz Balsalobre Arenas

Antonia Hernández Madrid

Personal Técnico:

Alicia Rodríguez Bernabé (Auxiliar de Investigación de Laboratorio)

Unidad de Genética Bacteriana
Unidad de Genética Bacteriana

Líneas de investigación

Streptococcus pneumoniae (neumococo) es la principal causa de neumonía adquirida en la comunidad y está frecuentemente implicado en reagudizaciones de bronquitis crónicas, meningitis, otitis medias y sinusitis. La resistencia de neumococo a fármacos antibacterianos, incluyendo los b-lactámicos, macrólidos y co-trimoxazol, se ha extendido en todo el mundo en los últimos años y ha impulsado, por una parte, la búsqueda de nuevas dianas de acción de antibacterianos (como es la ATPasa de membrana F0F1) y, por otra, el desarrollo de nuevos fármacos más activos. Entre estos últimos destacan especialmente las fluoroquinolonas (Fqs).

Bases moleculares de la susceptibilidad de S. pneumoniae a fluoroquinolonas.

Las nuevas Fqs (levofloxacina, moxifloxacina y gemifloxacina) se utilizan actualmente en el tratamiento de enfermedades respiratorias en adultos y aunque la prevalencia actual de cepas de S. pneumoniae resistentes es todavía baja (generalmente inferior al 3%), su emergencia puede llegar a ser un problema clínico importante. Por otra parte, la resistencia entre los estreptococos viridans, bacterias comensales que comparten nicho ecológico con neumococo en la nasofaringe y causan endocarditis y bacteriemia en pacientes inmunocomprometidos, es superior a la de neumococo (13% en Canadá, 20% en Europa). Existe una correlación entre el incremento en el consumo de Fqs y el incremento en la prevalencia de resistencia tanto en neumococo como en estreptococos viridans. Además la administración previa de estos fármacos selecciona cepas resistentes, tanto cuando neumococo es la bacteria causante de la infección, como se ha demostrado en fallos terapéuticos de neumonía neumocócica, como cuando está presente como comensal en la nasofaringe. El hecho de que la frecuencia de resistencia a Fqs en estreptococos viridans sea mayor que en S. pneumoniae y la detección por nuestro grupo de cepas de neumococo recombinantes que han adquirido mutaciones de resistencia por transferencia horizontal desde los estreptococos viridans, permite concluir que estos están actuando como reservorio de la resistencia a Fqs. Un trabajo reciente de nuestro grupo indica que las cepas de S. pneumoniae resistentes a Fqs se han seleccionado de entre las pertenecientes a los clones epidémicos multirresistentes y que, entre ellas, se encuentran cepas recombinantes que pertenecen a los clones Spain23F-1 y Spain6B-2, prevalentes en la población . La diseminación de la resistencia a Fqs a través de estos clones, incluyendo las cepas recombinantes, puede provocar un aumento rápido de la resistencia en S. pneumoniae si se incrementa el consumo de estos fármacos.

La resistencia a Fqs ocurre principalmente por alteración de los blancos celulares: DNA topoisomerasa IV (topo IV) y DNA girasa (girasa). Estas enzimas esenciales controlan la topología del DNA y actúan trasladando una hélice de DNA sobre otra, a través de una rotura transitoria de doble cadena para lo cual requieren de la hidrólisis del ATP. La girasa cataliza la introducción de vueltas superhelicoidales negativas en el DNA y está implicada en los procesos de replicación, reparación, recombinación y transcripción, mientras que la topo IV actúa en la segregación de los cromosomas después de la replicación. Ambas son proteínas tetraméricas compuestas por dos subunidades distintas: GyrA2GyrB2 (girasa) y ParC2ParE2 (topo IV), siendo ParC y ParE de neumococo homólogas a GyrA y GyrB, respectivamente. Mientras que GyrA y ParC llevan a cabo la rotura y reunión del DNA, GyrB y ParE realizan la hidrólisis de ATP. Las Fqs inhiben la reacción de superenrollamiento mediada por la girasa y la de decatenación mediada por la topo IV, provocando, principalmente, la inhibición de la replicación del cromosoma bacteriano. Además actúan como venenos intracelulares al estabilizar un intermediario de reacción del mecanismo catalítico de dichas enzimas en el que la topoisomerasa queda unida covalentemente al DNA por medio de un enlace fosfotirosina. La estabilización de dicho complejo origina roturas de doble cadena en el DNA, que, por mecanismos hasta el momento desconocidos, originan la muerte celular. Trabajos de nuestro grupo (así como de otros grupos) han mostrado que las mutaciones responsables de resistencia a Fqs en neumococo se localizan en las “regiones determinantes de resistencia a quinolonas” (QRDRs) de los dominios N-terminales de parC y gyrA y de los C-terminales de GyrB y ParE (los dominios de interacción de GyrB con GyrA y de ParC con ParE). Estudios genéticos y bioquímicos en S. pneumoniae han demostrado que la topo IV es el blanco primario para las Fqs y la girasa el secundario. Las cepas con bajo nivel de resistencia tienen mutaciones que alteran la subunidad ParC de la topo IV. Las cepas con alto nivel de resistencia tienen cambios en las QRDRs de ParC y GyrA o de ParE y GyrA. En S. pneumoniae estas mutaciones pueden adquirirse tanto por mutación como por transferencia horizontal.

Dianas celulares de las Fqs
Dianas celulares de las Fqs

Un mecanismo adicional de resistencia a Fqs es la actividad aumentada de bombas de expulsión activa, lo que reduce la concentración intracelular del antimicrobiano y por tanto restringe su acceso a los blancos celulares. Estas bombas, codificadas por genes cromosómicos, se encuentran en la membrana interna y están presentes tanto en bacterias sensibles como resistentes. La resistencia resulta de la sobre-expresión de las bombas por mutaciones en las regiones promotoras. Aunque este mecanismo es de importancia clínica en bacterias Gram-negativas, de momento, el impacto clínico en S. pneumoniae es discutible, puesto que las cepas que presentan fenotipo de bomba de expulsión tienen bajo nivel de resistencia a Fqs hidrofílicas, las menos activas frente a S. pneumoniae y estreptococos viridans. Las bombas presentes en bacterias Gram-positivas transportan, además de Fqs, multitud de sustratos, que incluyen bromuro de etidio, acriflavina. En S. pneumoniae se ha descrito una única bomba, PmrA, que confiere resistencia a norfloxacina y bromuro de etidio. Sin embargo, la selección de mutantes resistentes a bromuro de etidio, que a su vez muestran expulsión activa de Fqs, en una cepa con una interrupción en pmrA indica que PmrA no es la única bomba implicada en expulsión activa de Fqs.

Las bombas de expulsión pueden contribuir al incremento de la resistencia en una cepa que posea mutaciones en las DNA topoisomerasas. Tampoco hay que descartar la transferencia de genes de bombas desde los SGV, en los cuales también existe este mecanismo.

Bases moleculares de la susceptibilidad de S. pneumoniae a compuestos antimaláricos.

S. pneumoniae muestra una sensibilidad característica a las drogas antimaláricas de tipo amino alcohol tales como optoquina, quinina y mefloquina. La sensibilidad a la optoquina es una prueba, a veces la única, que se utiliza en los laboratorios clínicos para diferenciar neumococo de otros estreptococos a-hemolíticos (estreptococos viridans). Nuestro grupo ha establecido que la especial sensibilidad de neumococo a los antimaláricos de tipo amino alcohol radica en las características de su ATPasa de membrana F0F1. Esta enzima consiste en dos complejos: F1 (a, b, d, g, x) citoplásmico, donde reside el sitio catalítico para la hidrólisis de ATP, y F0 (a, c, b) transmembranal, que forma el canal de protones. Las características estructurales de las subunidades c y a del complejo F0, son responsables de la sensibilidad a drogas antimaláricas de tipo amino-alcohol. Las mutaciones responsables de resistencia a antimaláricos se localizan en una de las dos a-helices de membrana de la subunidad c, o bien en las a-hélices de membrana 5 ó 6 de la subunidad a. Los compuestos antimaláricos inhiben específicamente la ATPasa F0F1, existiendo una correlación directa entre el nivel de inhibición de la actividad enzimática y el nivel de inhibición del crecimiento bacteriano. Las a-helices de las subunidades c y a interaccionarían entre sí para presentar de forma correcta el grupo carboxilo esencial para la translocación de protones (presente en la subunidad c). La interacción del antimalárico con dichas subunidades produciría un cambio conformacional en F0 impidiendo la presentación correcta de dicho grupo.

Modelo estructural
Modelo estructural

La función de la ATPasa F0F1 es la de acoplar la energía derivada del gradiente electroquímico de protones con la síntesis de ATP y es esencial en S. pneumoniae. Dependiendo del organismo y de las condiciones de crecimiento, la enzima funciona en la dirección de síntesis de ATP, o bien de hidrólisis de ATP. En organismos con cadena respiratoria, como Escherichia coli, su papel primario es la síntesis de ATP a partir del gradiente de protones generado por la cadena respiratoria. En bacterias que carecen de cadena respiratoria, la enzima genera un gradiente de protones transmembranal (que se utiliza en procesos de transporte) con la energía liberada por la hidrólisis del ATP y mantiene el pH intracelular vía extrusión de protones. Este es el caso de S. pneumoniae, los estreptococos orales, Enterococcus hiriae, Lactobacillus acidophilus y Lactococcus lactis. En todas estas especies la actividad de la ATPasa aumenta cuando el pH del medio disminuye. La regulación de este proceso ocurre en L. acidophilus por medio de incremento del mRNA del operon atp. En E. hirae el control parece ejercerse a nivel del ensamblaje de la enzima. En S. pneumoniae la actividad de la ATPasa F0F1 aumenta aproximadamente 2 veces cuando el pH del medio se acidifica en aproximadamente 2 unidades de pH (de 7.5 a 5.7) y supondría la adaptación de la bacteria a los diferentes lugares en que se encuentra (tracto respiratorio superior, tracto respiratorio inferior, líquido cefalorraquídeo, sangre). El incremento de actividad ATPasa F0F1 se debe a un incremento en la transcripción del operón que codifica las ocho subunidades de la ATPasa y está regulado a nivel de iniciación de transcripción. Nuestro grupo ha determinado recientemente que la respuesta a cambio de pH representa una respuesta celular global, como se ha descrito en otras especies de estreptococos

Proyectos de investigación

  • FIS 00/0258 (2000-2002)


  • BIO 2002-01398 (2002-2004)


  • Red temática de Investigación Cooperativa del FIS G03/103 (2003-2006)


  • BIO2005-02189 (2005-2007)


Publicaciones

Instituto de Salud Carlos III. Servicios de Información Internet