Líneas de Investigación
La línea de investigación principal del grupo se centra en el estudio de la biología de células madre neurales (y pluripotenciales) y su posible aplicación terapéutica en neurodegeneración. Nuestro foco actualmente son en la Enfermedad de Parkinson y Enfermedad de Alzheimer. Esta línea se divide en 3 sublíneas.
ENFERMEDAD DE PARKINSON:
Mecanismos celulares y moleculares que regulan el desarrollo y diferenciación de las neuronas dopaminérgicas mesencefálicas. Las neuronas dopaminérgicas en mamíferos se generan en el denominado "midbrain"; en este proceso participan una complicada red de factores de transcripción y secretados, ya conocidos. Otros factores aún están por descubrir. Un mejor conocimiento del desarrollo y de los factores moleculares implicados en la neurogénesis dopaminérgica es esencial para mejorar los actuales protocolos de diferenciación de células madre hacia fenotipo dopaminérgico "in vitro", y con ello a su aplicación terapéutica.
| Figure 1. A) Parkinson disease is characterized by the degeneration of dopaminergic neurons of the
substantia nigra pars compacta. B)During development, dopaminergic neurons are generated at midbrain level; some transcription factors such as Lmx1a are essential for the generation of dopamine neurons. C)Dopaminergic neurons can be generated "in vitro" from different types of stem cells by using the appropriate differentiation protocols. Liste et al., unpublished. |
ENFERMEDAD DE ALZHEIMER: Papel de la Proteína Precursora Amiloide (APP) y sus derivados proteolíticos en la biología, diferenciación, muerte y especificación de células madre neurales. La implicación patológica de la APP y sus derivados (sobre todo el péptido B amiloide) en Alzheimer, está bien demostrada. Sin embargo, estas proteínas también desempeñan un papel importante, poco conocido todavía, en la biología/fisiología normal del sistema nervioso en desarrollo y adulto. Nuestro objetivo es profundizar en el papel fisiológico de estas proteínas a nivel de la biología de células madre neurales, y así poder regular/modular estos efectos y encontrar nuevas dianas terapéuticas para el tratamiento de E. Alzheimer y/o S. de Down
| Figure 2. A) Amyloid precursor protein (APP) post-traductional processing . B) Microphotographs of human neural stem cells (hNSCs) in proliferation and after differentiation expressing different markers of neurons (BIIITub) or glial cells (GFAP). C, D) APP overexpression in hNSCs inhibit neuronal differentiation and enhances glia differentiation. Coronel et al., unpublished. |
Generación y caracterización de células iPS a partir de células somáticas usando vectores no integrativos.
Cultivos en 2D y 3D de células ES/iPS (murinas y humanas) para generación de “mini-cerebros” in vitro (organoides).
Metodología más relevante: Cultivos primarios de neuronas (precursores de neuronas dopaminérgicas y/o corticales). Cultivo y diferenciación de células madre neurales murinas y humanas. Aislamiento de blastocistos de ratón; expansión, proliferación, caracterización fenotípica y diferenciación dirigida de células madre pluripotenciales (embrionarias e iPS). Reprogramación de células somáticas mediante vectores no integrativos y su caracterización. Cultivos en 3D para la generación de "mini-cerebros" u organoides. Técnicas de inmunocitoquímica, inmunohistoquímica, western blot, PCR; transfección, nucleofección, y biología molecular básica.
Modelos experimentales: diferenciación temprana y neurogénesis del sistema nervioso "in Vitro" (usando como herramienta la diferenciación dirigida de células madre embrionarias y células madre neurales) tanto bidimensionales con en 3D, e "in vivo" (desarrollo embrionario en cerebro de ratón control o transgénico).
2.2 REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GENÉTICA POR LOS RECEPTORES NUCLEARES DE HORMONAS, DAÑO GENÓMICO Y SENESCENCIA CELULAR. FIBROSIS PULMONAR
Interés científico e introducción. Nuestro interés científico abarca la regulación transcripcional mediada por los llamados receptores nucleares de hormonas (RNHs), el daño genómico (DD) y la senescencia celular (SC). Estamos interesados en la Fibrosis Pulmonar Idiopática (FPI), una enfermedad crónica fatal de origen desconocido y sin tratamiento efectivo. En el contexto de la FPI convergen muchos aspectos moleculares y celulares que nos interesan, relacionados con los RNHs, el DD, y la SC. Además, estamos desarrollando un modelo experimental para estudiar esta enfermedad, que consiste en la generación de células epiteliales diferenciadas humanas (minipulmón en dos y tres dimensiones) a partir de las llamadas células troncales embrionarias humanas pluripotentes (hESCs). Estas investigaciones nos permitirán analizar diversos ligandos para los RNHs y compuestos con potencial antifibrótico que puedan tener un interés terapéutico para la FPI y otras patologías fibrosantes. También nos permitirán asentar las bases de nuevas terapias celulares basada en la biotecnología de las células pluripotentes.
La superfamilia de los RNHs incluye a receptores para un gran número de ligandos como la vitamina D, hormonas tiroideas, ácido retinoico, etc. y están implicados en la regulación del crecimiento, diferenciación, embriogénesis o el metabolismo. Además de estas actividades, muchos de estos ligandos pueden influir en procesos como el daño genómico y la senescencia celular (SC). La SC es un estado de parada proliferativa irreversible como respuesta a un daño genómico o estrés cuyo principal objetivo es evitar la proliferación de las células dañadas. Además de esta función preeminente, la SC puede tener lugar de forma programada durante el desarrollo del organismo, en ausencia de daño genómico, y participar así en la morfogénesis y eliminación de estructuras transitorias del embrión. La función genérica de la SC, propuesta recientemente, es la de inducir el proceso de remodelación tisular que puede tener lugar durante el desarrollo embrionario o en respuesta al daño tisular. En este sentido, la SC puede influir en multitud de procesos fisiológicos y patológicos. Así, en diversas patologías crónicas que cursan con fibrosis tisular, la SC puede tener un valor beneficioso o perjudicial dependiendo del contexto donde tenga lugar. En la FPI existe una pérdida progresiva de la función pulmonar debida a la deposición excesiva de matriz extracelular por fibroblastos activados, inducida por una respuesta al daño tisular persistente. En este contexto, la expresión de la SC tanto en células epiteliales como en fibroblastos, agrava enormemente la patología.
Figure 3. Induction of pulmonary fibrosis by bleomycin. Representative micrographs of Masson´s staining. Zambrano A © unpublished
data
Figure 4. Bleomycin-induced fibrosis. Normal (saline)
vs fibrotic lung (Bleo.). Zambrano A © unpublished data
Objetivos principales
Análisis de diversos ligandos para los RNHs y compuestos de interés en el contexto de fibrosis pulmonar.
Expresión del daño genómico e influencia de la SC en células epiteliales y fibroblastos.
Desarrollo de modelo de fibrosis pulmonar basada en el antibiótico bleomicina
Generación de células epiteliales humanas a partir de hESCs (minipulmones en dos y tres dimensiones)
Metodología más relevante y modelos experimentales. Técnicas básicas de un laboratorio de Bioquímica y Biología molecular. Western-blot, inmunoprecipitación de proteínas, inmunofluorescencia, inmunohistoquímica, RT-qPCR, inmunoprecipitación de cromatina (ChIP, Re-ChIps). Técnicas para el análisis de la senescencia celular y del daño genómico: citometría de flujo, actividad b-galactosidasa asociada a senescencia (SA-bgal), evaluación de especies reactivas de oxígeno (ROS), roturas en el DNA, irradiación con rayos g, respuesta al daño genómico. Cultivos celulares primarios de fibroblastos y de células epiteliales pulmonares, líneas inmortalizadas, expansión y mantenimiento de hESCs, diferenciación inespecífica y específica de células pluripotentes. Inducción de fibrosis in vitro e in vivo basada en el antibiótico bleomicina.
Figure 5. Expression of
DNA damage foci under different stress conditions. Representative images of TP53BP1 immunostaining
Zambrano et al. JCB 2014
Proyectos
Título: Desarrollo, diferenciación y maduración de las neuronas dopaminérgicas mesencefálicas: Implicación de P27 Kip1. Ref: SAF2015-71140-R
Entidad Financiadora: MINECO (PROGRAMA RETOS DE LA SOCIEDAD; convocatoria 2015)
DURACIÓN DESDE: 2016 HASTA: 2019
INVESTIGADOR/A PRINCIPAL:
Isabel Liste
Título: Estudio de la Biología de Células madre neurales para su empleo en terapia celular en enfermedades neurodegenerativas. Acrónimo: NEUROSTEMCM. Ref: P2010/BMD2336.IP:
Isabel Liste + otros 6 grupos; coordinadora: Rosario Moratalla, Instituto Cajal, CSIC.
Entidad Financiadora: Comunidad de Madrid consorcios en Biomedicina. Consorcio formado por 7 grupos, incluido el del grupo receptor.
Duración: Enero 2012 -Diciembre 2015
Título: Las células troncales pluripotenciales como posible fuente celular de neuronas Dopaminérigcas funcionales y su aplicación en modelos animales de Enfermedad de Parkinson. IP: Isabel Liste
Entidad Financiadora: Fondo de Investigaciones Sanitarias (FIS) (Ref: PI10/00291)
Duración: Enero 2011 - 2015.
Título: Terapia celular en neurodegeneración
Entidad financiadora: ISCIII (proyecto emergente); ref. MPY1412/09
Duración: 2010 -2012
Investigador Principal: Isabel Liste
Título: Transcriptional Regulation of the Inflammatory Response by Human Respiratory Syncytial Virus.
Entidad financiadora: ISCIII
Desde 03/03/2014 hasta 29/12/2017
Dotación: 120400 Euros.
Investigador Principal: Alberto Zambrano
Título: Exploring the Potential Therapeutic Use of Prosenescence and Antisenescence Compounds for the Disease Caused by Human Respiratory Syncytial Virus.
Grant: Compound Transfer Program de Pfizer
Desde 11/2015 hasta 11/2018
Investigador Principal: Alberto Zambrano
Título: Influencia del virus respiratorio sincitial humano en daño genómico y senescencia celular.
Entidad financiadora: ISCIII
Desde 2016 hasta 2019
Dotación: 69500 Euros.
Investigador Principal: Alberto Zambrano